南开大学杨志谋课题组：预组装增强自组装多肽的水解性能

南开大学生命科学学院杨志谋课题组发现：不同磷酸化位点的自组装前体分子采用酶促自组装（EISA）后，能制备一系列具有相同化学组成但具有不同催化性能的人工酯酶。通过改变多肽前体分子中磷酸化酪氨酸的位置，多肽前体分子预组装成不同的纳米材料。经过碱性磷酸酶（ALP）去磷酸化反应之后，具有更强的预组装状态的多肽前体分子自组装形成更有序、均匀且水解活性更高的纳米材料。该研究为制备高催化活性的人工催化体系提供了一个新的策略和方法。

在构建人工酶的基础材料中，基于多肽的材料因其与天然酶的相似性而具有广阔的应用前景。然而，多肽的折叠过程复杂且难以控制，这导致所得人工酶的催化效率和底物特异性低。超分子组装是一个由非共价相互作用驱动的过程，它提供了一种调控多肽折叠的通用策略。组装途径对于多肽折叠的结果和产生的纳米材料的性质至关重要，已有开创性研究表明，改变组装途径可导致结构、形态和功能的变化。目前已有多种策略用来调节多肽的组装，包括酶促自组装，氧化还原反应，温度、pH、离子强度的变化以及剪切力的引入等。其中，酶促自组装能在动力学和热力学过程中强有力地控制自组装，因此具有很大优势。最近，南开大学杨志谋课题组报道了一种新的策略，采用酶促自组装方法制备了一系列化学组成成分相同但催化性能不同的人工酯酶，并测定了它们催化水解的能力。

作者首先设计并合成了三个磷酸化多肽，分别为Nap-pYYYH(1)、Nap-YpYYH(2)和Nap-YYpYH(3)。从N-端到C-端，它们在酪氨酸（Y）上具有不同的磷酸化位点，组氨酸含有水解酶功能重要的咪唑基团，用来模拟极简化酯酶。三个化合物（1，2和3）均形成质量浓度为0.5 wt%的透明溶液，用激光笔照射溶液可以看到不同强度的光路。在ALP存在时，三个化合物去磷酸化后分别产生白色沉淀、不透明水凝胶和透明水凝胶（图1）。这说明通过调节磷酸根的位置可以调节具有相同化学成分多肽的组装性能。

图1  不同位置磷酸化酪氨酸多肽前体分子的分子设计及其预组装和成胶性能 

为了进一步了解ALP存在下不同磷酸化位点对转化速率和转化前后纳米结构的影响，作者首先研究了在ALP存在时三个化合物去磷酸化速率，它们都经历了明显的去磷酸化过程，其中，预组装状态越好的化合物去磷酸化速率越快。测定了去磷酸化前后三个化合物的临界聚集浓度（CAC），结果也表明预组装状态越好的化合物组装能力越强（图2）。

图2  磷酸化位点影响去磷酸化速率和临界聚集浓度 

作者表征了三种化合物在去磷酸化前后的结构和形态的变化。在加入ALP之前，化合物1和2为无规则卷曲构象，形成无定形和离散的组装体；化合物3为α-螺旋构象，由短纤维形成。在加入ALP之后，化合物1为α-螺旋构象，化合物2和3为β-sheet构象，它们的微观结构均形成纤维，但纤维簇的厚度和密度变化明显（图3）。这些结果表明预组装程度越强的前体，经过去磷酸化反应后，形成的组装体越均匀。

图3  磷酸化位点的位置决定了去磷酸化前后的微观结构特性 

随后，作者探究了去磷酸化后的组装体作为人工酯酶的活性。选取4-硝基苯基乙酸酯作为酯酶催化的底物，测试了去磷酸化后组装体的酶动力学，并计算出水解反应的绝对速率常数（k_cat/K_m）(图4)。结果表明在所有测得的组别中，去磷酸化3具有最快的水解速率和最高的水解效率。以上结果再次证明了预组装能力越强的前体分子，酶促自组装形成的纳米纤维具备更强的酯酶水解活性。

图4  前体去磷酸化后形成的组装体具有不同的水解酶活性 

作者通过调节多肽前体分子预组装状态的策略，利用酶促自组装方法制备出最终效应产物一样，但微观结构和形貌不一样的纳米纤维。通过仅仅改变磷酸化多肽前体分子的磷酸化位点来调节其预组装状态，使得前体分子预组装成结构和形貌不同的预组装体。经过碱性磷酸酶的脱磷酸化作用后，预组装程度强的前体分子排列组装成更为均一、稳定有序的纳米纤维且具备更强的酯酶水解活性；而预组装程度弱的前体分子排列组装成形貌不均一的纳米结构，酯酶水解活性也相对较弱。本研究结果表明基于酶促自组装的预组装策略为构建具有最佳催化活性的人工酶提供了一种通用方法。

论文第一作者为南开大学生命科学学院博士陈瑶霞，通讯作者为南开大学生命科学学院杨志谋教授、药学院王玲研究员。详见: Yaoxia Chen, Wenwen Zhang, Yinghao Ding, Chunhui Liang, Yang Shi, Zhi-wen Hu, Ling Wang, Zhimou Yang. Preorganization boosts the artificial esterase activity of a self-assembling peptide. Sci. China Chem., 2021, DOI:10.1007/s11426-021-1029-x.

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通讯作者简介

杨志谋，南开大学生命科学学院生物活性教育部重点实验室主任，教授，博导。主要从事短肽水凝胶的可控制备及生物医疗应用领域的研究。在SCI收录期刊上发表论文160余篇，论文他引>8,000次，个人h-index为58。曾获天津市自然科学一等奖（第一完成人），天津市劳动模范等荣誉称号。 王玲，南开大学药学院研究员，主要研究领域为多肽可控自组装及生物医疗应用。本科毕业于南京理工大学，硕士毕业于南京大学高分子系，博士毕业于香港科技大学化学系，斯坦福大学病原体及微生物系访问学者，2009年加入南开大学。曾获天津市自然科学一等奖（第3与第4完成人），至今发表SCI论文40余篇。

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